元素形态分析的硒元析样样品前处理不同于传统的总量分析,在前处理方法上需要保持元素的素形现有形态,因此也不能沿用传统的态分用于总量分析的酸消解方法和灰化法。元素形态分析的品前样品前处理一般分以下几个步骤:
① 样品制备及试样的储存;
② 目标分析物的选择性提取;
③ 必要时,形态分离前的处理衍生化。
1. 富硒大蒜中硒的技术形态分析(γ-Glu-MeSeCys、MeSeCys、硒元析样SeMet、素形Se(VI))
(1)水溶液萃取
精确称取干燥的态分大蒜样品0.2g于带有塞子的聚乙烯瓶中,加入10mL盐酸羟胺溶液。品前新鲜的处理大蒜拨皮,称取大约20g蒜瓣,技术直接加入200mL同样的硒元析样溶液,均一化样品。素形样品放入37℃水浴中,态分磁力搅拌1小时。离心后过滤。
(2)酶萃取
精确称取0.2g干燥的大蒜样品于带有塞子的玻璃管中,加入10mL水和20mg蛋白酶,在37℃条件下磁力搅拌24小时。样品离心后经0.45μm滤膜过滤。
注:酶萃取效率几乎是100%,水溶液萃取的应用主要是查找易发生变化的selenoamino acids。
2. 天然蘑菇与富硒蘑菇中硒的形态分析(SeMet和未知硒形态)
(1) 水萃取(37℃或85℃):
精确称取0.2g冻干样品,加入5mL Milli-Q水,样品置于浸没式数字控制自动调温器中,在相应温度下加热1h。
(2) 蛋白酶水解
精确称取0.2g冻干的蘑菇样品,加入20mg蛋白酶和5g Milli-Q水,在37℃条件下反应16h。萃取完后,离心,经0.45μm的滤膜过滤。
注:天然蘑菇采用水萃取程序和蛋白酶水解程序,萃取效率相差不多。富硒蘑菇采用蛋白酶水解程序,萃取效率比水萃取程序高。
3. 牡蛎组织样品中硒的形态分析(Se(IV)、SeCys2、TMSe+、SeMet、Se(VI))
称取0.25g冻干的牡蛎组织样品,加入10%(w/w)非特征性枯草杆菌蛋白酶,在pH 7.50,37℃条件下,反应24h,重复上述步骤2次,合并反应液,经10kDa定点过滤器超过滤。
4. 环境样品中硒的形态分析(有机硒)
以甲醇/水(1:1,v/v)或甲醇/水(1:1,v/v)-0.28mol/L HCl或甲醇/水(1:1,v/v)-4%NH3.H2O为提取液,置于盛有一定量试样的刻度管中,超声30min后离心,收集上层清液,重复上述过程1次,合并上清液,经0.45μm滤膜过滤,调节pH为7.0左右后测定。
对于非固体环境样品,如尿样,用水精确稀释(1+4)后直接测定。
5. 沉积物中硒的形态分析(Se(IV)、Se(VI))
精确称取一定量样品于聚苯乙烯离心管中,加入2mol/L氢氧化钠溶液,超声4h,离心,经0.45μm滤膜过滤,调节pH为7.0左右后测定。
6.亚硒酵母片中硒的形态分析(SeCys、Se(IV)、SeMet、SeMeCys)
精确称取1.0g样品于50mL离心管中,加入25mL去离子水,离心管放于沸水浴中加热1h,混合物每15min摇匀1次,萃取完毕,样品离心,经0.22μm尼龙过滤器过滤。
7. 发酵粉和米粉中硒的形态分析(SeCys、SeMet、SeMeCys、Se(IV)、Se(VI))
精确称取0.4g米粉,加入40mg蛋白酶,20mg脂肪酶和5g Milli-Q水,在37℃条件下反应16h。水解后的样品离心(4000g,45min,15℃),过滤。对于发酵粉,样品量和各种酶的用量都减半。
8.尿样中硒的形态分析(SeCys、Se(IV)、SeMet、SeMeCys)
精确量取10mL尿样,加入2mL 3%乙酸,摇5min,用去离子水稀释至25mL。样品离心后经0.22μm尼龙过滤器过滤。
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